基因治疗，彻底“唤醒”耳朵

耳聋（Hearingloss，HL）是人类最常见的感官功能致残性疾病。在发达国家，儿童语前发生的耳聋病例中，约80%是由遗传因素造成的。最常见的是单基因缺陷（如Fig1），已发现124个基因突变与人类的非综合征性听力损失有关，其余由环境因素引起。迄今为止，人工耳蜗(一种放置在内耳的电子设备，直接向听神经提供电刺激)是治疗重度HL最有效的选择，而助听器(一种用于转换和放大声波的外置电子设备)可以帮助中度HL患者。然而，目前还没有可用的药物治疗遗传性HL(GHL)。近年来，基因治疗作为治疗内耳功能障碍的一种有前途的方法受到越来越多的关注。

Fig1. Distribution of deafness-associated variation type.[1]

近日，来自salk研究所和谢菲尔德大学的科学家在MolecularTherapy – Methods & ClinicalDevelopment上发表了一项研究成果[2]，其对遗传性耳聋在体基因治疗方面表现出了广阔的应用前景。

Salk研究所的助理研究教授兼Waitt高级生物光子学中心主任——Uri Manor提到，他生来就患有严重的听力损失，觉得能够为人们恢复听力将是一份美妙的礼物。他此前的研究发现，Eps8是一种肌动蛋白调节蛋白，具有肌动蛋白捆绑和加帽活性；在耳蜗毛细胞中，Eps8与MYO15A、WHIRLIN、GPSM2和GNAI3形成的蛋白复合物主要存在于最长静纤毛的尖端，其与MYO15A一起将BAIAP2L2定位在较短的静纤毛尖端，是维持毛束所必需的功能。因此，Eps8可通过调节毛细胞立体纤毛的长度，对行使正常听力功能至关重要；而Eps8缺失或突变会导致立体纤毛较短，使其不能正常将声音转为大脑感知电信号，进而导致耳聋。同时，合作者、谢菲尔德大学教授WalterMarcotti发现，Eps8缺失情况下，毛细胞也不能正常发育。

在这项研究中，Manor和Marcotti联手研究了在立体纤毛毛细胞中添加Eps8是否可以恢复其功能，进而改善小鼠的听力。研究小组利用腺相关病毒(AAV)载体Anc80L65将含有野生型EPS8的编码序列，通过圆窗膜注射方式将其递送至Eps8-/-新生P1-P2小鼠的耳蜗中；在小鼠耳蜗毛细胞发育成熟前对其及立体纤毛功能进行修复；并利用成像技术及立体纤毛长度测量对修复效果进行表征。结果显示，Eps8增加了立体纤毛的长度，并恢复了低频细胞的毛细胞功能。他们还发现，经过一段时间后，细胞似乎失去了通过这种基因疗法拯救的能力。暗示这种治疗方法可能需要在子宫内进行，因为在小鼠出生后，Eps8-/-毛细胞可能已经成熟或积累了超出可修复的损伤。

Manor提到：“Eps8是一种具有多种不同功能的蛋白质，目前仍有很多东西需要探索”。未来的研究将包括探究Eps8基因治疗在不同发育阶段恢复听力的效果，以及是否有可能延长治疗机会。

无独有偶，2020年11月，以色列特拉维夫大学KarenB Avraham教授曾在EMBO MolecularMedicine杂志上发表成果[3]，采用了一项创新的基因治疗技术，创造了一种无害的合成腺相关病毒AAV9-PHP.B，通过将携带Syne4编码序列的病毒注入小鼠的内耳，并使其进入毛细胞并释放所携带的遗传物质，从而修复了Syne4-/-小鼠毛细胞的基因缺陷，使其能够成熟和正常发挥功能（如Fig2）。

Fig2. Schematic representation of inner ear anatomy, with a focus on theorgan of Corti and the cellular function of nesprin-4.

由此可见，利用基因治疗的方式，在基因水平上通过插入、移除或纠正任何针对治疗的突变基因（即控制疾病中的基因变化），达到治疗遗传性疾病的目的，具有较高的临床应用前景。目前针对遗传缺陷型耳聋的基因治疗方法可分为以下几种：

基因替换

基因替换可以说是最“直接”的基因治疗形式，基于识别并用正常或野生型拷贝基因补充替换缺陷基因。首个成功的内耳基因治疗研究是治疗了由囊泡谷氨酸转运体3(VGLUT3)基因缺失引起的听力损失；由AAV1介导递送外源性VGLUT3在内耳毛细胞(IHCs)中的过度表达可导致持续的听力恢复、部分带状突触形态恢复和惊厥反应[4]。然而，包括上文导读中介绍的两种AAV递送基因替换的示例中，需注意的是，某些类型基因缺失遗传性听力损失疾病所用的小鼠模型与人类存在时间差异，在P1小鼠中，内耳处于发育成熟阶段。相比之下，人类天生就有成熟的内耳。这一差异阻止了小鼠结果可能应用于人类遗传性耳聋疾病的治疗中，除非将基因治疗递送至成熟的小鼠耳朵。

基因编辑：CRISPR/Cas9

相对于“基因替换”而言，基因编辑技术的发展为从根源上治疗遗传性疾病带来了曙光。重要的是，基因编辑的方式弥补了传统过表达的基因治疗方法不适合显性遗传性耳聋疾病的弊端，及过表达方式效期不持久的问题。中国研究人员通过AAV-SaCas9-KKH-Myo6-g2基因编辑系统特异性地敲除Myo6WT/C442Y小鼠中的Myo6C442Y突变等位基因后，并在敲除后的5个月内，观察到小鼠模型听觉功能的恢复；同时，还观察到内耳毛细胞存活率提高、纤毛形态变规则，电生理指标得到纠正[5]。这是国际上首个利用CRISPR/Cas9技术针对Myo6基因突变导致的遗传性耳聋进行治疗，并获得成功的研究，是基因编辑技术用于遗传性耳聋治疗的重要研究进展，为遗传性耳聋基因精准治疗临床转化提供了坚实的科学依据。

基因治疗递送方式

为了使基因治疗取得成功，裸露的DNA分子由于其亲水性及磷酸基团负电荷特点而不能有效地穿透细胞，且保证所补充核酸分子的完整性，必须选择一种安全有效的方法将补充的DNA递送至靶细胞或组织中。AAV由于其较高的感染效果、免疫原性低，对多种组织类型具有广泛的趋向性等特点，被广泛用来作为疾病治疗的递送载体。目前，大量的研究工作已经确定了不同亚型AAV在小鼠耳蜗中相对于不同细胞类型的趋向性。利用AAV递送特性结合细胞特异性启动子可以实现细胞特异性表达，可以达到降低脱靶效应的效果。除此，作为传统AAV载体的替代品，新的合成AAV载体不断被开发出来，并在内耳显示出优越的转导能力，其中应用最广泛的是AAV2/Anc80L65。非病毒递送方法可进一步分为物理方法(显微注射和电穿孔)和化学方法(脂基、聚合物基和金纳米颗粒)。这两种方法都被应用于遗传性耳聋疾病的治疗中，并显示出不同的优点和局限性。

除了基因治疗的递送载体作为媒介外，基于不同的靶细胞类型、给药途径和治疗效力，可以采用不同的方法进行活体基因给药。内耳错综复杂的结构导致难以到达靶细胞，基因组编辑剂分布缓慢。膜迷路位于颞骨的骨迷路内，包括耳蜗管、半圆形导管、椭圆囊和球囊。其相对孤立，淋巴循环最少，通过血液迷宫屏障与血液隔开，这三个因素限制了治疗药物仅有效地系统性地输送到新生小鼠。为了获得合适基因治疗的病毒滴度，将病毒载体直接局部注射到内耳是必要的。已建立的注射途径包括[6]：(1)圆窗膜(RWM)，(2)管造口术，(3)内淋巴或外淋巴腔内耳蜗造口术，(4)圆窗膜加管开窗(CF)(如Fig3)。

Fig3. Inner ear delivery of gene therapy.

虽然目前在基因治疗方面已经取得了许多进展，然而基于临床转化目标，在基因治疗能够成为遗传病患者的一线治疗选择之前，还需要做更多的工作，特别是在开发安全有效的载体和传递方法方面。但我们相信，在不久的将来，这些类型的治疗将成为个性化治疗的主要内容，并将对遗传病患者及其家人的生活产生巨大的积极影响。

参考文献：

[1]Ding N etal.Advances in genome editing for genetic hearing loss. Adv Drug DelivRev. 2021 Jan;168:118-133.

[2]Jing-Yi Jeng etal.AAV-mediated rescue of Eps8 expression in vivo restores hair functionin a mouse model of recessive deafness. Molecular Therapy–Methods &Clinical Development. 2022 Jul; 26: 355-370

[3]TaiberS etal.Neonatal AAV gene therapy rescues hearing in a mouse model of SYNE4deafness. EMBO Mol Med. 2021 Feb 5;13(2):e13259.

[4]AkilOet al.Restoration of hearing in the VGLUT3 knockout mouse using virallymediated gene therapy. Neuron. 2012 Jul 26;75(2):283-93. 

[5]Yuanyuan Xue et al.Gene editing in a Myo6 semi-dominant mouse model rescues auditoryfunction. Mol Ther.2022 Jan 5;30(1):105-118.

[6]OmichiR etal.Gene therapy for hearing loss. Hum Mol Genet. 2019 Oct1;28(R1):R65-R79. 

E.N.D

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